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內(nèi)切酶切不開(kāi)或不*的問(wèn)題探索

發(fā)布時(shí)間: 2020-03-31  點(diǎn)擊次數(shù): 1435次
   內(nèi)切酶的酶切出現(xiàn)問(wèn)題,先看內(nèi)切酶說(shuō)明書(shū),相應(yīng)試劑公司目錄。不同公司出產(chǎn)的內(nèi)切酶,菌株來(lái)源、制備工藝、純度活力、酶切活性優(yōu)化可能不同,酶切效果也有差別??稍谏厦嬲业矫竼挝欢x、保存條件、酶切體系、酶切反應(yīng)溫度、酶是否受甲基化影響等。
  1.質(zhì)粒問(wèn)題
  制備不當(dāng)?shù)腄NA樣品、純度差或殘留酶切污染(抑制物)。雜蛋白存在會(huì)影響酶切,表現(xiàn)為A260/A280低于1.8;抑制物常見(jiàn)酚、乙醇、蛋白質(zhì)、EDTA、SDS、高鹽等。
  A260/A280是在測(cè)量DNA、RNA提純后的純度的,如果有蛋白質(zhì)污染,這個(gè)比值就比較小。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)在280處有吸收值。高純度的DNA、RNA這個(gè)比值應(yīng)該在1.8-2左右。
  2.酶的問(wèn)題
  確認(rèn)內(nèi)切酶有效(很多內(nèi)切酶雖然有過(guò)期時(shí)間,但過(guò)期后只要能夠有效酶切,可用。確認(rèn)酶切效果不好,做標(biāo)記,更換)。
  3.buffer問(wèn)題
  有些酶切的buffer中,添加了一些較為容易析出或溶解的成分,有時(shí)酶切的buffer沒(méi)有*融化時(shí),buffer的濃度是不均一的。新的buffer先融化的部分,鹽離子濃度要高,使用一段時(shí)間后,融化部分的離子濃度會(huì)變低。通常,這種影響不大,但如果是使用一些對(duì)離子濃度敏感的內(nèi)切酶時(shí)就會(huì)出現(xiàn)問(wèn)題。
  4.雙酶切的buffer選擇
  確認(rèn)使用的是正確的buffer和反應(yīng)溫度。
  5.酶切位點(diǎn)的甲基化影響
  限制性內(nèi)切酶不能切割甲基化的識(shí)別序列。常見(jiàn)的有Xba I、Bcl I等。甲基化主要分為Dam、Dcm和CpG甲基化等。大腸桿菌等原核生物具有限制-修飾系統(tǒng),Dam、Dcm常使DNA樣品甲基化而不被切割。如果是直接從哺乳動(dòng)物細(xì)胞中提取的DNA,則部分DNA會(huì)因CG methylase的影響而被甲基化。一些酶切位點(diǎn)被甲基化后,酶切會(huì)受影響。因此,出現(xiàn)酶切不開(kāi)或不全時(shí)需要考慮甲基化的問(wèn)題。
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